Genetik mühendisliğinin özü. Genetik mühendisliği. Toprak agrobakterilerinin kullanımı

Genetik (genetik) mühendisliği– genetik yapıların ve kalıtsal olarak değiştirilmiş organizmaların yapay yapımı. Genetik mühendisliği, bir konakçı hücrede çoğalma yeteneğine sahip yeni DNA moleküllerinin hedeflenen şekilde oluşturulmasıyla ilişkili moleküler genetiğin bir bölümüdür (uygulamalı dal). Bu durumda organizmanın genotipinde (mikroorganizma) yapay, amaçlı bir değişiklik meydana gelir ve yeni özellikler ve özellikler oluşur. Genetik mühendisliği, genlerin yapısının çözülmesi, sentezi ve klonlanması ve canlı organizma hücrelerinden izole edilen genlerin, genetik özelliklerini spesifik olarak değiştirmek amacıyla bitki ve hayvan hücrelerine yerleştirilmesiyle ilgilenir.

Genetik mühendisliğinin iyi geliştirilmiş yöntemleri transgenesis, mikrobiyolojik sentez vb.'dir.

Transgenesis– genlerin bir organizma türünden diğerine aktarılması. Transgenesis, enzimlerin - kısıtlama enzimlerinin ve ligazların katılımıyla DNA bölümlerinin kesilmesi ve dikilmesiyle gerçekleştirilir.

Transgenesis aşamaları:

a) genlerin (DNA fragmanlarının) bakteri, bitki veya hayvan hücrelerinden bir enzim kullanılarak izolasyonu Kısıtlama enzimleri;

b) genlerin (DNA fragmanlarının) bir enzim kullanılarak bir plazmid ile bağlanması (bağlanması) ligazlar;

c) arzu edilen geni içeren bir hibrit plazmit DNA'nın konakçı hücreye yerleştirilmesi;

d) Bu genin konak hücreye kopyalanması (klonlanması) ve “DNA kodu – transkripsiyon – translasyon – protein” şemasına göre çalışmasının sağlanması

Genetik mühendisliği araçları 1974'te keşfedilen enzimler nelerdir - kısıtlama enzimleri (restriksiyon endonükleazları). Kısıtlama enzimleri, DNA'nın bölümlerini (bölgelerini) tanır ve DNA iplikçiklerinde kesimler yapar. Her parçanın ucunda “tek iplikçikli kuyruklar” adı verilen kuyruklar oluşur. yapışkanlı sonlar"çünkü tamamlayıcılık nedeniyle adeta birbirine yapışabilirler.

Kısıtlama enzimleri, çift sarmallı DNA'daki spesifik bir DNA nükleotid dizisini tanır. Kısıtlama enzimi daha sonra tanınan nükleotid bölgesine bağlanır ve onu bağlanma bölgesinde keser. Daha sık olarak, kısıtlama enzimleri bir DNA molekülünde 4-6 nükleotid çiftinden oluşan bölgeleri tanır ve her iki DNA zincirini bu bölgelerin ortasından veya genellikle bir ofsetle keser. Kısıtlama enzimlerinin örnekleri: Kısıtlama enzimi Eko RI altı nükleotid GAATTC'nin bir DNA parçasını tanıyan (her iki DNA zincirinin G ve A nükleotidleri arasındaki kesim bölgesi); Kısıtlama enzimi Arka III AAGCTT bölgesini tanır (her iki DNA zincirinin A ve A nükleotitleri arasındaki kesim bölgesi); Kısıtlama enzimi Bam ben GGATCC bölgesini tanır (her iki DNA zincirinin G ve G nükleotidleri arasındaki kesim bölgesi); Kısıtlama enzimi Hae III GGC bölgesini tanır (her iki DNA zincirinin G ve C nükleotidleri arasındaki kesim bölgesi); Kısıtlama enzimi Hpa II CCGG bölgesini (her iki DNA zincirinin C ve C nükleotidleri arasındaki kesim bölgesi) tanır.

Daha sonra genetiği değiştirilmiş bir organizma oluşturmak için istenen genin bu organizmanın hücresine yerleştirilmesi gerekir. Yabancı genlerin vücuda sokulması kullanılarak gerçekleştirilir. plazmit vektörü. vektör plazmit – küçük dairesel DNA molekülü bir bakteri hücresinin sitoplazmasından elde edilen bir madde. Plazmidler– kromozomların dışında bulunan kalıtım faktörleri; kromozom dışı DNA.

Pirinç. 37.

A– Enzimler (restriksiyon endonükleaz ve ligaz) kullanılarak yabancı DNA'nın bakteriyel bir plazmit içerisine yerleştirilmesine yönelik şema.

B– İnsülin hormonunun sentezinden ve vektör DNA'nın oluşumundan sorumlu insan gen transfer şeması.

Plazmidin özellikleri: 1) otonom replikasyon yeteneğine sahiptir; 2) antibiyotikleri kodlayan genleri içerir; 3) alıcı hücrenin kromozomuna entegre olabilme; 4) kısıtlama enzimleri tarafından kesilebilen DNA bölümlerini tanır; 5) bir kısıtlama enzimi plazmidi kesebilir ve onu doğrusal bir duruma aktarabilir. Araştırmacılar plazmitin bu özelliklerini elde etmek için kullanıyorlar. rekombinant (hibrit) DNA.

Bir kısıtlama enzimi kullanılarak DNA'nın bir plazmit (plazmit vektörü) içine dahil edilme dizisi(Şekil 37 A):

1) kısıtlama– DNA molekülünün bir restriksiyon enzimi ile kesilmesi, DNA fragmanlarının oluşması ve gerekli genin izolasyonu;

2) izole edilmiş genin bir plazmide dahil edilmesi yani yabancı DNA'nın bir fragmanının bir plazmid içerisine yerleştirilmesiyle rekombinant (hibrit) DNA'nın elde edilmesi;

3) ligasyon– enzim çapraz bağlanması ligaz plazmid (vektör) ve yabancı DNA fragmanları; bu durumda vektörün ve yabancı DNA'nın uçları ("yapışkan uçlar" olarak adlandırılır) birbirini tamamlayıcı niteliktedir;

4) dönüşüm- rekombinant bir plazmitin başka bir hücrenin (alıcı hücre), özellikle bir bakteri hücresinin genomuna dahil edilmesi.

Plazmitlerin tedavi edilen bakterilerin yalnızca bir kısmına nüfuz ettiğine dikkat edilmelidir. Dönüştürülen bakteriler, plazmidlerle birlikte belirli bir antibiyotiğe karşı direnç kazanır, bu da onları, antibiyotik içeren bir ortamda ölen, dönüştürülmemiş bakterilerden ayırmayı mümkün kılar. Besleyici bir ortama yerleştirilen dönüştürülmüş bakterilerin her biri çoğalır ve binlerce soyundan oluşan bir koloni - bir klon - oluşturur.

5) tarama- İstenilen gene sahip plazmitleri içeren dönüştürülmüş bakteriler arasından seçim.

Transgenik hayvanlar ve bitkiler

Klonlanmış genler, mikroenjeksiyon kullanılarak memeli yumurtalarına veya bitki protoplastlarına (hücre duvarı olmayan izole bir hücre) yerleştirilir ve daha sonra bunlardan, genomunda yabancı genlerin çalıştığı hayvanlar veya bitkiler yetiştirilir. Genetik mühendisliği işlemleriyle genomları değiştirilen bitki ve hayvanlara ne ad verilir? transgenik organizasyonlar (transgenik bitkiler ve hayvanlar)Çünkü yabancı genler içeriyor. Transgenik fareler, tavşanlar, domuzlar ve koyunlar elde edildi. Genomları bakterilerden, memelilerden ve insanlardan gelen genleri içerir. İlgisiz türlerden genler içeren transgenik bitkiler (mısır, biber, domates, buğday, çavdar, baklagiller, patates vb.) elde edilmiştir. Transgenik bitkiler herbisitlere, böceklere, olumsuz yağmur koşullarına vb. karşı dayanıklıdır. Birçok tarım bitkisinin kalıtımını değiştirme sorunu yavaş yavaş çözülmektedir.

Kromozomların genetik haritası. Gen tedavisi

Kromozomların genetik haritası, aynı bağlantı grubunda yer alan genlerin göreceli düzenlemesinin bir diyagramıdır. Bu tür haritalar her bir homolog kromozom çifti için derlenir. Genetik harita, kromozom üzerindeki genlerin sırasını ve aralarındaki mesafeyi (belirli genler arasındaki geçiş yüzdesi) gösterir. Dolayısıyla hormonları, proteinleri ve ilaçları sentezleyebilen yeni mikroorganizma türlerinin oluşturulması, mikroorganizmaların genetik haritalarının bilgisine dayanmaktadır. İnsan genetik haritaları tıbbi genetik için gereklidir. Bir genin belirli bir kromozom üzerindeki lokalizasyonu hakkındaki bilgi, bir dizi kalıtsal hastalığın teşhisinde ve ayrıca genlerin yapısını ve işlevini düzeltmek için gen terapisinde kullanılır.

Gen tedavisi - Arızalı genlerin sağlam olanlarla değiştirilmesi veya yapılarının düzeltilmesi.

Kalıtsal, onkolojik ve yaşa bağlı hastalıklarla mücadele etmek için insan hücreleri için güvenli gen terapisi yöntemleri geliştirilmektedir. Gen terapisi yöntemleri kullanılarak vücutta nokta mutasyonların meydana geldiği kusurlu genlerin sağlam genlerle değiştirilmesi mümkündür. Günümüzde bilim insanları yöntemler konusunda uzmanlaşıyor insan biyogüvenliği: gerekli genlerin insan vücudunun hücrelerine yerleştirilmesi. Bu, birçok kalıtsal hastalıktan kurtulmanızı sağlayacaktır.

Mikrobiyolojik sentez

Genetik mühendisliği yöntemleri uygulanmasını mümkün kıldı mikrobiyolojik sentez(Şekil 37 B). Mikrobiyologlar, genetik mühendisliği yöntemlerini kullanarak, mikrobiyolojik sentezin başarıyla gerçekleştirildiği bakteri türlerini elde edebildiler. Bunun için plazmit içermeyen gerekli bakteri hücreleri seçilir. Belirli bir nükleotid dizisine sahip DNA molekülleri izole edilir ve bu, istenen özelliğin gelişimini belirler. Entegre bir DNA bölümüne (genom) sahip bir plazmit, yerleşik DNA bölümünün çalışmaya başladığı (çoğaltma, transkripsiyon, translasyon işlemlerinin gerçekleştiği) ve gerekli proteinin (interferon, geneferon, immünoglobulin, insülin, somatotropin vb.) bakteri hücresinde sentezlenir. Hormonlar (insülin, somatotropin), birçok amino asit, antibiyotik, aşı vb. endüstriyel miktarlarda elde edilir.Bu tür bakteriler endüstriyel ölçekte çoğalarak gerekli proteini üretirler.

Genetik yöntemler kullanılarak, orijinal formdan on kat daha fazla C vitamini ve B vitamini üreten Pseudomonas denitrificans mikroorganizmasının bir türü elde edildi; Micrococcus glutamicus bakterisinin yeni bir türü, lizin üreten bakterinin orijinal (vahşi) kültüründen yüzlerce kat daha fazla amino asit lizini salgılıyor.

Hücre mühendisliği

Hücre mühendisliği- bireysel hücrelerin veya dokuların özel yapay ortamlarda yetiştirilmesi, bunları hibritleyerek yeni bir hücre türü oluşturma, kromozomları değiştirme ve onlardan hibritler yetiştirme yöntemlerinin geliştirilmesi.

1. Doku kültürü yöntemi

Yöntem, izole edilmiş hücrelerin veya doku parçalarının, uygun mikroiklim koşulları altında yapay bir besin ortamı üzerinde yetiştirilmesinden oluşur. Yetiştirme sonucunda bitki hücreleri veya doku parçaları bütün bir bitki halinde yeniden üretilir. Bireysel hücrelerin veya doku parçalarının (genellikle bir kök veya kökün apikal meristemi) mikroklonal çoğaltılmasıyla birçok faydalı bitki elde edilebilir. Süs, kültür ve tıbbi bitkilerin rejenerasyonu için mikroklimatik koşullar ve besin ortamları deneysel olarak seçilir. Doku kültürü aynı zamanda orijinal haploid formların kolşisin ile işlenmesinden sonra diploid bitkiler üretmek için de kullanılır.

2. Somatik hibridizasyon

Somatik hibridizasyon, hibrit hücrelerin ve onlardan yeni formların üretimini içerir; yumurtaların yapay gübrelenmesi.

Çeşitli hücrelerin protoplastlarının (çekirdek ve sitoplazma) doku kültüründe füzyonu yoluyla yeni hibrit bitkiler elde edilmesi. Protoplastların kaynaşması için bitki hücre duvarı enzimlerin yardımıyla yok edilir ve izole edilmiş bir protoplast elde edilir. Farklı bitki türlerinin bu tür protoplastları yetiştirildiğinde, birleşerek yeni yararlı özelliklere sahip formlar oluştururlar. Yumurtaların yapay döllenmesi, yumurtaların in vitro döllenmesine ve daha sonra embriyonun gelişimin erken bir aşamasında implantasyonuna olanak tanıyan ve insanlarda bazı kısırlık biçimlerinin üstesinden gelmesini sağlayan in vitro fertilizasyon (IVF) yöntemi kullanılarak gerçekleştirilir.

3. Kromozom mühendisliği– bitki hücrelerindeki bireysel kromozomların değiştirilmesi veya yenilerinin eklenmesi. Diploidlerin homolog kromozom çiftleri vardır ve bu tür organizmalara disomik denir. Herhangi bir çiftte bir kromozom kalırsa monozomi oluşur. Herhangi bir çifte üçüncü bir homolog kromozom eklerseniz, bir trizomik oluşur vb. Bir türün bireysel kromozomlarını başka bir türün kromozomlarıyla değiştirmek mümkündür. Kabul edilmiş formlara ikame denir.

Modern dünyada genetik mühendisliğinin başarıları hakkında hiçbir şey duymamış birini bulmak zordur.

Bugün biyoteknolojiyi geliştirmenin, tarımsal üretimi, ilacı ve diğer birçok endüstriyi geliştirmenin en umut verici yollarından biridir.

Genetik mühendisliği nedir?

Bilindiği gibi, herhangi bir canlının kalıtsal özellikleri vücudun her hücresinde bir dizi gen - karmaşık protein moleküllerinin elemanları - şeklinde kaydedilir. Canlı bir canlının genomuna yabancı bir gen ekleyerek, ortaya çıkan organizmanın özelliklerini istediğiniz yönde değiştirebilirsiniz: mahsulü dona ve hastalığa karşı daha dayanıklı hale getirin, bitkiye yeni özellikler verin, vb.

Bu tür bir değişiklik sonucunda elde edilen organizmalara genetiği değiştirilmiş veya transgenik adı verilir ve modifikasyonların incelenmesi ve transgenik teknolojilerin geliştirilmesiyle ilgilenen bilimsel disipline genetik veya genetik mühendisliği denir.

Genetik mühendisliğinin nesneleri

Genetik mühendisliği araştırmalarının en yaygın nesneleri mikroorganizmalar, bitki hücreleri ve alt hayvanlardır, ancak memeli hücreleri ve hatta insan vücudundaki hücreler üzerinde de araştırmalar yürütülmektedir. Kural olarak, araştırmanın doğrudan amacı diğer hücresel maddelerden arındırılmış bir DNA molekülüdür. DNA, enzimler yardımıyla ayrı bölümlere ayrılır ve istenilen bölümü tanıyıp izole edebilmek, enzimler yardımıyla aktarabilmek ve diğer DNA'nın yapısına entegre edebilmek önemlidir.

Modern teknikler halihazırda genomun bölümlerini oldukça serbestçe manipüle etmeyi, kalıtsal zincirin istenen bölümünü çoğaltmayı ve onu alıcının DNA'sındaki başka bir nükleotidin yerine yerleştirmeyi mümkün kılıyor. Kalıtsal mekanizmaların yapısının yasaları hakkında oldukça fazla deneyim birikmiş ve önemli bilgiler toplanmıştır. Kural olarak, tarım bitkileri, temel gıda ürünlerinin verimliliğini önemli ölçüde artırmayı zaten mümkün kılan dönüşümlerden geçmektedir.

Genetik mühendisliğine neden ihtiyaç duyulur?

Yirminci yüzyılın ortalarına gelindiğinde, geleneksel yöntemler artık bilim adamlarına uygun değildi, çünkü bu yönün bir takım ciddi sınırlamaları vardı:

• ilgisiz canlı türleri arasında geçiş yapmak imkansızdır;
• genetik özelliklerin rekombinasyon süreci kontrolsüz kalır ve yavrularda gerekli nitelikler rastgele kombinasyonlar sonucunda ortaya çıkarken, yavruların çok büyük bir yüzdesi başarısız olarak kabul edilir ve seçim sırasında atılır;
• Geçiş sırasında istenen nitelikleri doğru bir şekilde belirtmek imkansızdır;
• Üreme süreci yıllar, hatta on yıllar alır.

Kalıtsal özelliklerin korunmasına yönelik doğal mekanizma son derece stabildir ve istenen niteliklere sahip yavruların ortaya çıkması bile bu özelliklerin sonraki nesillerde korunmasını garanti etmez.

Genetik mühendisliği yukarıdaki tüm zorlukların üstesinden gelmemizi sağlar. Transgenik teknolojilerin yardımıyla, genomun bireysel bölümlerinin başka türlere ait canlılardan alınan bölümlerle değiştirilmesiyle belirli özelliklere sahip organizmalar yaratmak mümkündür. Aynı zamanda yeni organizmalar yaratmak için gereken süre de önemli ölçüde azalır. Gerekli özellikleri sabitleyerek onları kalıtsal hale getirmek gerekli değildir, çünkü sonraki partileri genetik olarak değiştirmek ve süreci tam anlamıyla akışa geçirmek her zaman mümkündür.

Transgenik bir organizma yaratmanın aşamaları

1. İstenilen özelliklere sahip izole edilmiş bir genin izolasyonu. Bugün bunun için oldukça güvenilir teknolojiler var, hatta özel hazırlanmış gen kütüphaneleri bile var.
2. Transfer için bir genin bir vektöre yerleştirilmesi. Bunu yapmak için, özel bir yapı oluşturulur - bir veya daha fazla DNA segmenti ve düzenleyici element içeren, vektör genomuna yerleştirilen ve ligazlar ve kısıtlama enzimleri kullanılarak klonlamaya tabi tutulan bir transgen. Dairesel bakteriyel DNA - plazmitler - genellikle bir vektör olarak kullanılır.
3. Vektörün alıcının vücuduna dahil edilmesi. Bu süreç, bir virüsün veya bakterinin DNA'sının konakçı hücrelere yerleştirilmesi şeklindeki benzer doğal süreçten kopyalanır ve aynı şekilde çalışır.
4. Moleküler klonlama. Bu durumda, modifikasyona uğrayan hücre başarılı bir şekilde bölünerek, modifiye edilmiş genomu içeren ve belirli özelliklere sahip protein moleküllerini sentezleyen birçok yeni yavru hücre üretir.
5. GDO seçimi. Son aşamanın sıradan yetiştirme çalışmalarından hiçbir farkı yoktur.

Genetik mühendisliği güvenli midir?

Transgenik teknolojilerin ne kadar güvenli olduğu sorusu hem bilim camiasında hem de bilimden uzak medyada periyodik olarak gündeme getirilmektedir. Bunun henüz kesin bir cevabı yok.

Birincisi, genetik mühendisliği biyoteknolojinin oldukça yeni bir alanı olmaya devam ediyor ve bu sorun hakkında objektif sonuçlar çıkarmamıza olanak tanıyan istatistikler henüz birikmedi.

İkinci olarak, çok uluslu gıda şirketlerinin genetik mühendisliğine yaptığı devasa yatırımlar, ciddi araştırma eksikliğinin ek bir nedeni olabilir.


Ancak birçok ülkenin mevzuatı, üreticilere, gıda grubu ürünlerinin ambalajlarında GDO'lu ürünlerin varlığını belirtme zorunluluğu getiren düzenlemeler getirmiştir. Her durumda, genetik mühendisliği, teknolojilerinin yüksek etkinliğini zaten kanıtlamıştır ve daha da geliştirilmesi, insanlara daha fazla başarı ve başarı vaat etmektedir.

VE BİYOTEKNOLOJİ

“Bilgi şu şekilde belirlenir:

iddia ettiğimiz şey

Gerçek gibi"

P. A. FLORENSKY.

Modern biyoloji, yalnızca bilişsel fikirlerin gelişiminin daha derin olması açısından değil, aynı zamanda toplum yaşamı ve uygulamayla daha yakın bağlantısı açısından da geleneksel biyolojiden kökten farklıdır. Çağımızda biyolojinin, toplumun maddi ihtiyaçlarını karşılamak amacıyla yaşayan dünyayı dönüştürmenin bir aracı haline geldiğini söyleyebiliriz. Bu sonuç, öncelikle, daha önce insan tarafından yaratılan mekanik ve kimyasal teknolojilerin eşit ortağı olan, malzeme üretiminin en önemli alanı haline gelen biyoloji ve biyoteknoloji arasındaki yakın bağlantıyla gösterilmektedir. Biyoteknolojinin yükselişini ne açıklıyor?

Biyoloji ve biyoteknoloji, başlangıçtan bu yana her zaman birlikte gelişmiştir; biyoloji, en başından beri biyoteknolojinin bilimsel temelini oluşturmuştur. Ancak uzun süre kendi verilerinin olmayışı biyolojinin biyoteknoloji üzerinde çok büyük bir etkiye sahip olmasına izin vermedi. 20. yüzyılın ikinci yarısındaki yaratılışla birlikte durum çarpıcı biçimde değişti. "yeni oluşturmak ve mevcut genotipleri yeniden yapılandırmak" amacıyla genetik manipülasyon olarak anlaşılan genetik mühendisliği metodolojisi. Doğası gereği metodolojik bir başarı olan genetik mühendisliği, biyolojik olaylarla ilgili mevcut fikirlerde bir kopuşa yol açmadı, biyolojinin temel ilkeleri, nasıl radyo astronomisi astrofiziğin temel ilkelerini sarsmadıysa, "ısının mekanik eşdeğeri"nin bulunması da ısıl iletkenlik yasalarında bir değişikliğe yol açmadı ve atomik madde teorisinin ispatı termodinamik, hidrodinamik ve esneklik teorisi arasındaki ilişkileri değiştirmedi.

Genetik mühendisliği, genlerin yapısını ve işlevini daha etkin bir şekilde incelemek, canlı maddenin varoluş biçimlerini daha da karakterize etmek amacıyla biyolojik olayların derinliklerine nüfuz etmek için yeni fırsatların ortaya çıkması nedeniyle biyolojide yeni bir çağ açmıştır. moleküler düzeyde ve genetik aparatın işleyişinin ince mekanizmalarını anlamak. Genetik mühendisliğinin başarıları modern doğa biliminde bir devrim anlamına geliyor. Canlı maddenin moleküler ve hücresel seviyelerinin yapısal ve işlevsel özellikleri hakkındaki modern fikirlerin değeri için kriterleri belirlerler. Canlılara ilişkin modern veriler, eğitimsel öneme sahiptir, çünkü organik dünyanın en önemli yönlerinden birinin anlaşılmasını sağlar ve böylece dünyanın bilimsel bir resminin yaratılmasına paha biçilmez bir katkı sağlar. Böylece, genetik mühendisliği yoluyla biyoloji, bilişsel temelini önemli ölçüde genişleterek, biyoteknolojinin yükselişinde de öncü bir etkiye sahip oldu.

Genetik mühendisliği, yeni organizmalar "inşa etmenin" veya mevcut organizmaları iyileştirmenin yollarını ve araçlarını anlama yolunda temel oluşturur, onlara daha fazla ekonomik değer ve biyoteknolojik süreçlerin verimliliğini keskin bir şekilde artırma konusunda daha fazla yetenek kazandırır.

Genetik mühendisliği çerçevesinde genetik mühendisliği ile hücresel mühendislik arasında bir ayrım yapılır. Genetik mühendisliği, rekombinant DNA molekülleri oluşturmak için yapılan manipülasyonları ifade eder. Bu metodolojiye sıklıkla moleküler klonlama, gen klonlama, rekombinant DNA teknolojisi veya basitçe genetik manipülasyon adı verilir. Genetik mühendisliğinin nesnelerinin DNA molekülleri ve bireysel genler olduğunu vurgulamak önemlidir. Buna karşılık, hücre mühendisliği, izole edilmiş bireysel hücrelerin veya bitki ve hayvan hücre gruplarının genetik manipülasyonunu ifade eder.

Bölüm XIX

GENETİK MÜHENDİSLİĞİ

Genetik mühendisliği, DNA moleküllerinin (genlerin) belirli amaçlar için tasarlanmasını (yeniden yapılandırılmasını) ve klonlanmasını sağlayan çeşitli deneysel teknikler (teknikler) kümesidir.

Genetik mühendisliği yöntemleri belirli bir sırayla kullanılır (Şekil 221) ve bir geni klonlamayı amaçlayan tipik bir genetik mühendisliği deneyinin gerçekleştirilmesinde birkaç aşama ayırt edilir:

1. İlgili organizmanın hücrelerinden DNA'nın izolasyonu (ilk) ve DNA vektörünün izolasyonu.

2. Kısıtlama enzimlerinden birini kullanarak orijinal organizmanın DNA'sının ilgili genleri içeren parçalara kesilmesi (kısıtlanması) ve bu genlerin elde edilen kısıtlama karışımından izole edilmesi. Aynı zamanda, vektör DNA kesilerek (kısıtlanarak) dairesel bir yapıdan doğrusal bir yapıya dönüştürülür.

3. Hibrit DNA molekülleri elde etmek için ilgilenilen DNA segmentinin (gen) vektör DNA'ya bağlanması.

4. Hibrit DNA moleküllerinin başka bir organizmaya, örneğin E. coli'ye veya somatik hücrelere dönüştürülmesi yoluyla dahil edilmesi.

5. Yalnızca hibrit DNA molekülleri içeren hücrelerin büyümesine izin veren besin ortamına hibrit DNA moleküllerinin eklendiği bakterilerin ekimi.

6. Hibrit DNA molekülleri içeren bakterilerden oluşan kolonilerin tanımlanması.

7. Klonlanmış DNA'nın (klonlanmış genler) izolasyonu ve klonlanmış DNA fragmanındaki azotlu bazların sekanslanması dahil karakterizasyonu.

DNA (kaynak ve vektör), enzimler, DNA'nın klonlandığı hücreler - bunların hepsine genetik mühendisliğinin “araçları” denir.

DNA ekstraksiyonu

Örnek olarak DNA plazmidlerini kullanarak DNA izolasyon yöntemini ele alalım. Plazmit içeren bakteri hücrelerinden gelen DNA, deterjanların varlığında hücre ekstraktlarının elde edilmesini ve ardından fenol ekstraksiyonuyla ekstraktlardan proteinlerin çıkarılmasını içeren geleneksel bir teknik kullanılarak izole edilir (Şekil 222). Plazmid DNA'nın proteinlerden, RNA'dan ve diğer bileşiklerden tamamen saflaştırılması birkaç aşamada gerçekleştirilir. Hücreler, örneğin lizozim ile yok edildikten sonra (duvarları çözülür), zarları çözmek ve bazı proteinleri etkisiz hale getirmek için ekstrakta bir deterjan eklenir. Kromozomal DNA'nın çoğu, elde edilen preparatlardan geleneksel santrifüjleme yoluyla çıkarılır.

Kromatografi genellikle tam saflaştırma için kullanılır. Çok kapsamlı bir saflaştırma gerekiyorsa etidyum bromür kullanılarak yüksek hızlı CsCI yoğunluk gradyanlı santrifüjleme kullanılır. Geri kalan kromozomal DNA doğrusal DNA'ya bölünecek, plazmit DNA ise kovalent olarak kapalı kalacaktır. Etidyum bromür DNA'dan daha az yoğun olduğundan, bir santrifüj tüpünde ultrasantrifüjleme sırasında iki halka - plazmid DNA ve kromozomal DNA - "gevşeyecektir" (Şekil 223). Daha ileri çalışmalar için plazmid DNA seçilir, kromozomal DNA atılır.

Genetik mühendisliği, genotiplerin yeniden yapılandırılmasına ilişkin araştırmalarla ilgilenen bir biyoteknoloji yöntemidir. Genotip sadece genlerin mekanik toplamı değil, organizmaların evrimi sırasında gelişen karmaşık bir sistemdir. Genetik mühendisliği, genetik bilginin bir organizmadan diğerine in vitro işlemler yoluyla aktarılmasını mümkün kılar. Gen transferi, türler arası engellerin aşılmasını ve bir organizmanın bireysel kalıtsal özelliklerinin diğerine aktarılmasını mümkün kılar.

Genlerin maddi temelinin taşıyıcıları, DNA ve proteinleri içeren kromozomlardır. Ancak oluşum genleri kimyasal değil işlevseldir. İşlevsel açıdan bakıldığında, DNA, belirli miktarda bilgiyi (genleri) depolayan birçok bloktan oluşur. Genin etkisi, RNA yoluyla protein sentezini belirleme yeteneğine dayanmaktadır. DNA molekülü, protein moleküllerinin kimyasal yapısını belirleyen bilgileri içerir. Gen, herhangi bir proteinin (bir gen - bir protein) birincil yapısı hakkında bilgi içeren bir DNA molekülünün bir bölümüdür. Çünkü organizmalarda onbinlerce protein var, onbinlerce de gen var. Bir hücrenin tüm genlerinin toplamı onun genomunu oluşturur. Vücudun tüm hücreleri aynı gen setini içerir, ancak her biri depolanan bilginin farklı bir bölümünü uygular. Bu nedenle örneğin sinir hücreleri hem yapısal, hem işlevsel hem de biyolojik özellikler açısından karaciğer hücrelerinden farklılık gösterir.

Genetik mühendisliği görevlerini yerine getirirken genotiplerin yeniden düzenlenmesi, mikroskopta görülebilen kromozomların yapısındaki değişikliklerle ilişkili olmayan genlerdeki niteliksel değişiklikleri temsil eder. Gen değişiklikleri öncelikle DNA'nın kimyasal yapısındaki değişiklikleri içerir. Bir proteinin yapısı hakkında bir nükleotid dizisi olarak yazılan bilgi, sentezlenen protein molekülünde bir amino asit dizisi olarak uygulanır. Kromozomal DNA'daki nükleotid dizisindeki değişiklik, bazı nükleotidlerin kaybı ve diğer nükleotidlerin dahil edilmesi, DNA üzerinde oluşan RNA moleküllerinin kompozisyonunu değiştirir ve bu da sentez sırasında yeni bir amino asit dizisini belirler. Sonuç olarak hücrede yeni bir protein sentezlenmeye başlar ve bu da vücutta yeni özelliklerin ortaya çıkmasına yol açar. Genetik mühendisliği yöntemlerinin özü, bireysel genlerin veya gen gruplarının bir organizmanın genotipine eklenmesi veya bu genotipten çıkarılmasıdır. Daha önce bulunmayan bir genin genotipe eklenmesi sonucunda hücre, daha önce sentezlemediği proteinleri sentezlemeye zorlanabilir.

Genetik mühendisliğinin en yaygın yöntemi rekombinant elde etme yöntemidir, yani. yabancı bir gen olan plazmid içerir. Plazmitler, birkaç bin nükleotid çiftinden oluşan dairesel çift sarmallı DNA molekülleridir. Bu süreç birkaç aşamadan oluşur.

1. Kısıtlama - örneğin bir kişinin DNA'sının parçalara ayrılması.

2. Ligasyon - istenilen gene sahip bir fragman plazmidlere dahil edilir ve birbirine dikilir.

3. Transformasyon - rekombinant plazmitlerin bakteri hücrelerine sokulması. Dönüştürülmüş bakteriler belirli özellikler kazanır. Dönüştürülmüş bakterilerin her biri çoğalır ve binlerce nesilden oluşan bir koloni (bir klon) oluşturur.

4. Tarama - istenen insan genini taşıyan plazmitlere sahip olanların dönüştürülmüş bakteri klonları arasından seçim.

Bu sürecin tamamına klonlama denir. Klonlamayı kullanarak, bir kişiden veya başka bir organizmadan herhangi bir DNA parçasının bir milyondan fazla kopyasını elde etmek mümkündür. Klonlanmış parça bir proteini kodluyorsa, bu genin transkripsiyonunu düzenleyen mekanizmayı deneysel olarak incelemek ve bu proteini gerekli miktarda üretmek mümkündür. Ek olarak, bir organizmanın klonlanmış bir DNA fragmanı başka bir organizmanın hücrelerine yerleştirilebilir. Bu, örneğin bir dizi hastalığa karşı direnç sağlayan gen sayesinde yüksek ve istikrarlı verim elde edilebilir. Toprak bakterilerinin genotipine atmosferik nitrojeni sabitleme yeteneğine sahip diğer bakterilerin genlerini eklerseniz, o zaman toprak bakterileri bu nitrojeni sabit toprak nitrojenine dönüştürebilecektir. Bilim adamları, E. coli bakterisinin genotipine insan genotipinden insülin sentezini kontrol eden bir gen ekleyerek, bu tür E. coli yoluyla insülin üretimini başardılar. Bilimin daha da gelişmesiyle birlikte eksik genlerin insan embriyosuna aktarılması ve böylece genetik hastalıkların önlenmesi mümkün hale gelecektir.

Hayvan klonlama deneyleri uzun süredir devam ediyor. Çekirdeği yumurtadan çıkarmak, embriyonik dokudan alınan başka bir hücrenin çekirdeğini içine yerleştirmek ve onu bir test tüpünde veya evlat edinen bir annenin rahminde büyütmek yeterlidir. Klonlanmış koyun Doli alışılmadık bir şekilde yaratıldı. Bir cinsin 6 yaşındaki yetişkin bir koyununun meme hücresinden alınan bir çekirdek, başka bir cinsin koyununun nükleer içermeyen yumurtasına nakledildi. Gelişen embriyo üçüncü cins bir koyuna yerleştirildi. Yeni doğan kuzu, tüm genleri ilk donör koyundan aldığı için onun birebir genetik kopyasıdır. Bu deney, uzun yıllar süren seçilim yerine elit ırkların klonlanması için birçok yeni fırsatın önünü açıyor.

Teksas Üniversitesi'ndeki bilim adamları, çeşitli insan hücresi türlerinin ömrünü uzatmayı başardılar. Genellikle bir hücre yaklaşık 7-10 bölünme sürecinden geçtikten sonra ölür, ancak yüz hücre bölünmesini başarmışlardır. Bilim adamlarına göre yaşlanma, hücrelerin her bölünmede tüm kromozomların uçlarında bulunan moleküler yapılar olan telomerleri kaybetmesi nedeniyle oluşur. Bilim insanları, telomeraz üretiminden sorumlu olan geni hücrelere yerleştirip onları ölümsüz hale getirdi. Belki de ölümsüzlüğe giden gelecekteki yol budur.

80'li yıllardan beri insan genomunu incelemeye yönelik programlar ortaya çıktı. Bu programların yürütülmesi sürecinde halihazırda yaklaşık 5 bin gen okunmuştur (tam insan genomu 50-100 bin içerir). Bir dizi yeni insan geni keşfedildi. Genetik mühendisliği gen terapisinde giderek daha önemli hale geliyor. Çünkü birçok hastalık genetik düzeyde belirlenmektedir. Genomda birçok hastalığa yatkınlık veya direnç vardır. Pek çok bilim insanı, genom tıbbının ve genetik mühendisliğinin 21. yüzyılda işleyeceğine inanıyor.

Ekonomik önemi

Genetik mühendisliği, değiştirilebilir veya genetiği değiştirilmiş bir organizmanın istenen niteliklerinin elde edilmesine hizmet eder. Genotipin yalnızca dolaylı olarak değiştirildiği geleneksel seçilimin aksine, genetik mühendisliği, moleküler klonlama tekniğini kullanarak genetik aparata doğrudan müdahaleye izin verir. Genetik mühendisliğinin uygulama örnekleri, genetiği değiştirilmiş yeni tahıl mahsulleri çeşitlerinin üretilmesi, genetiği değiştirilmiş bakteriler kullanılarak insan insülininin üretilmesi, hücre kültüründe eritropoietin üretimi veya bilimsel araştırma için yeni deneysel fare türlerinin üretilmesidir.

Mikrobiyolojik, biyosentetik endüstrinin temeli bakteri hücresidir. Endüstriyel üretim için gerekli hücreler belirli özelliklere göre seçilir; bunlardan en önemlisi, belirli bir bileşiği (bir amino asit veya bir antibiyotik, bir steroid hormon veya bir organik asit) mümkün olan maksimum miktarlarda üretme, sentezleme yeteneğidir. . Bazen, örneğin yağı veya atık suyu "gıda" olarak kullanabilen ve onu biyokütleye ve hatta yem katkı maddeleri için oldukça uygun proteine ​​dönüştürebilen bir mikroorganizmaya ihtiyacınız vardır. Bazen yüksek sıcaklıklarda veya diğer mikroorganizma türleri için kesinlikle öldürücü olan maddelerin varlığında gelişebilen organizmalara ihtiyaç duyarız.

Bu tür endüstriyel suşların elde edilmesi görevi çok önemlidir; bunların modifikasyonu ve seçimi için, güçlü zehirlerle tedaviden radyoaktif ışınlamaya kadar hücreyi aktif olarak etkileyen çok sayıda yöntem geliştirilmiştir. Bu tekniklerin amacı tektir; hücrenin kalıtsal, genetik aparatında değişiklikler elde etmek. Bunun sonucunda çok sayıda mutant mikrop üretilir ve bilim insanları daha sonra yüzlerce ve binlerce mikrop arasından belirli bir amaç için en uygun olanı seçmeye çalışır. Kimyasal veya radyasyon mutagenez yöntemlerinin yaratılması biyolojinin olağanüstü bir başarısıydı ve modern bilimde yaygın olarak kullanılıyor. biyoteknoloji.

Ancak yetenekleri mikroorganizmaların doğası gereği sınırlıdır. Başta şifalı ve uçucu yağ bitkileri olmak üzere bitkilerde biriken bir takım değerli maddeleri sentezleyemezler. Hayvanların ve insanların yaşamı için çok önemli olan maddeleri, bir takım enzimleri, peptid hormonlarını, bağışıklık proteinlerini, interferonları ve hayvan ve insan vücudunda sentezlenen daha birçok basit bileşiği sentezleyemezler. Elbette mikroorganizmaların olanakları tükenmekten çok uzaktır. Mikroorganizmaların tüm bolluğundan yalnızca küçük bir kısmı bilim ve özellikle endüstri tarafından kullanıldı. Mikroorganizmaların seçimi amacıyla, örneğin oksijen yokluğunda yaşayabilen anaerobik bakteriler, bitkiler gibi ışık enerjisini kullanan fototroflar, kemoototroflar, son zamanlarda keşfedildiği gibi sıcaklıklarda yaşayabilen termofilik bakteriler büyük ilgi görmektedir. 110°C vb.

Ancak yine de "doğal malzemenin" sınırlamaları ortadadır. Bitki ve hayvanların hücre ve doku kültürleri yardımıyla kısıtlamaları aşmaya çalıştılar ve çalışıyorlar. Bu çok önemli ve ümit verici bir yoldur ve şu anda da uygulanmaktadır. biyoteknoloji. Geçtiğimiz birkaç on yıl boyunca bilim insanları, bir bitki veya hayvanın bireysel doku hücrelerinin, bakteri hücreleri gibi vücuttan ayrı olarak büyüyüp çoğalmasını sağlayacak yöntemler geliştirdiler. Bu önemli bir başarıydı; elde edilen hücre kültürleri deneylerde ve bakteri kültürleri kullanılarak elde edilemeyen bazı maddelerin endüstriyel üretiminde kullanılıyordu.

Gelişim tarihi ve ulaşılan teknoloji düzeyi

20. yüzyılın ikinci yarısında, birçok önemli keşif ve icat yapıldı. genetik mühendisliği. Genlerde "yazılı" olan biyolojik bilginin "okunması" için uzun yıllar süren çalışmalar başarıyla tamamlandı. Bu çalışma İngiliz bilim adamı F. Sanger ve Amerikalı bilim adamı W. Gilbert (Nobel Kimya Ödülü) tarafından başlatıldı. Bilindiği gibi genler, vücutta enzimler dahil olmak üzere RNA molekülleri ve proteinlerin sentezi için bilgi-talimatlar içerir. Bir hücreyi kendisi için alışılmadık yeni maddeleri sentezlemeye zorlamak için, ilgili enzim setlerinin hücrede sentezlenmesi gerekir. Ve bunun için ya içinde bulunan genleri bilinçli olarak değiştirmek ya da daha önce bulunmayan yeni genleri ona dahil etmek gerekir. Canlı hücrelerdeki genlerdeki değişiklikler mutasyonlardır. Örneğin mutajenlerin (kimyasal zehirler veya radyasyon) etkisi altında ortaya çıkarlar. Ancak bu tür değişiklikler kontrol edilemez veya yönlendirilemez. Bu nedenle bilim insanları, çabalarını, insanların ihtiyaç duyduğu yeni, çok spesifik genlerin hücrelere aktarılmasına yönelik yöntemler geliştirmeye odakladılar.

Bir genetik mühendisliği problemini çözmenin ana aşamaları şunlardır:

1. İzole edilmiş bir genin elde edilmesi. 2. Genin vücuda aktarılmak üzere bir vektöre dahil edilmesi. 3. Geni içeren vektörün değiştirilmiş organizmaya aktarılması. 4. Vücut hücrelerinin dönüşümü. 5. Genetiği değiştirilmiş organizmaların seçimi ( GDO) ve başarıyla değiştirilmeyenleri ortadan kaldırın.

Gen sentezi süreci artık çok iyi geliştirilmiş ve hatta büyük ölçüde otomatikleştirilmiştir. Hafızasında çeşitli nükleotid dizilerinin sentezine yönelik programların saklandığı bilgisayarlarla donatılmış özel cihazlar vardır. Bu aparat, uzunluğu 100-120 nitrojen bazına (oligonükleotidler) kadar olan DNA segmentlerini sentezler. Mutant DNA da dahil olmak üzere DNA sentezi için polimeraz zincir reaksiyonunun kullanılmasını mümkün kılan bir teknik yaygınlaştı. Yapay olarak sentezlenmiş nükleik asit parçalarının - oligonükleotitlerin - tohum olarak kullanıldığı şablon DNA sentezi için termostabil bir enzim olan DNA polimeraz kullanılır. Ters transkriptaz enzimi, bu tür primerleri kullanarak, hücrelerden izole edilmiş bir RNA şablonu üzerinde DNA'nın sentezlenmesine olanak tanır. Bu şekilde sentezlenen DNA'ya tamamlayıcı DNA (RNA) veya cDNA denir. İzole edilmiş, "kimyasal olarak saf" bir gen aynı zamanda bir faj kütüphanesinden de elde edilebilir. Bu, genom veya cDNA'dan rastgele parçaların genomun içine yerleştirildiği, faj tarafından tüm DNA'sıyla birlikte çoğaltılan bir bakteriyofaj preparatının adıdır.

Genleri bakterilere sokma tekniği, Frederick Griffith'in bakteriyel dönüşüm olgusunu keşfetmesinden sonra geliştirildi. Bu fenomen, bakterilerde kromozomal olmayan DNA'nın küçük parçalarının, plazmidlerin değişiminin eşlik ettiği ilkel bir cinsel sürece dayanmaktadır. Plazmid teknolojileri, yapay genlerin bakteri hücrelerine yerleştirilmesinin temelini oluşturdu.

Hazır bir genin bitki ve hayvan hücrelerinin kalıtsal aparatına dahil edilmesiyle önemli zorluklar ilişkilendirildi. Bununla birlikte, doğada, yabancı DNA'nın (bir virüs veya bakteriyofajın) bir hücrenin genetik aparatına dahil edildiği ve metabolik mekanizmalarının yardımıyla "kendi" proteinini sentezlemeye başladığı durumlar vardır. Bilim adamları yabancı DNA'nın girişinin özelliklerini incelediler ve bunu genetik materyali hücreye sokmak için prensip olarak kullandılar. Bu işleme transfeksiyon denir.

Tek hücreli organizmalar veya çok hücreli hücre kültürleri modifikasyona tabi tutulursa, bu aşamada klonlama başlar, yani modifikasyona uğramış organizmaların ve onların soyundan gelenlerin (klonların) seçimi başlar. Görev çok hücreli organizmalar elde etmek olduğunda, değiştirilmiş genotipli hücreler bitkilerin vejetatif çoğaltılması için kullanılır veya hayvanlar söz konusu olduğunda taşıyıcı annenin blastosistlerine yerleştirilir. Sonuç olarak, yavrular değiştirilmiş veya değişmemiş bir genotiple doğarlar; bunlardan yalnızca beklenen değişiklikleri sergileyenler seçilir ve birbirleriyle çaprazlanır.

Bilimsel araştırmalarda uygulama

Küçük ölçekte de olsa, bazı kısırlık türlerine sahip kadınlara hamile kalma şansı vermek için genetik mühendisliği halihazırda kullanılıyor. Bu amaçla sağlıklı bir kadının yumurtaları kullanılır. Sonuç olarak çocuk genotipi bir baba ve iki anneden miras alır.

Ancak insan genomunda daha önemli değişiklikler yapma olasılığı bir takım ciddi etik sorunlarla karşı karşıyadır.